第1部分：背景介紹

DNA 化學(xué)修飾為 DNA 序列編碼基因的表達(dá)增加了一層調(diào)控機(jī)制。這些化學(xué)修飾中，研究得最透徹的是 5-甲基胞嘧啶 (5mC)，該修飾被通常認(rèn)為是基因表達(dá)的一種穩(wěn)定的抑制性調(diào)控因子。人類基因組含有大約 1% 的甲基化胞嘧啶，因此其是非常廣泛的 DNA 修飾 。DNA甲基化(methylation)是一種表觀遺傳修飾，是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(Dnmt)的作用下將甲基選擇性地添加到胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）的過程。

5mC 最初被發(fā)現(xiàn)位于 CpG 島內(nèi)，CpG 島是富含CpG二核苷酸的基因啟動子區(qū)域常見的一段DNA片段。CpG島是一個富含CpG位點(diǎn)的區(qū)域，通常定義為：一個長度至少為200bp的片段，其GC含量高于60%，主要位于基因的啟動子區(qū)（70%的基因）。DNA甲基化主要發(fā)生在CpG位點(diǎn)。在哺乳動物中，70%到80%的CpG位點(diǎn)的胞嘧啶是甲基化的。

目標(biāo)區(qū)域甲基化重測序（Hi-MethylSeq），又叫重亞硫酸鹽擴(kuò)增子測序（Bisulfite Amplicon Sequencing，BSAS）。在前期全基因組甲基化測序、全基因組甲基化芯片等工作基礎(chǔ)上，或者依據(jù)文獻(xiàn)報道目的基因甲基化與性狀/疾病關(guān)聯(lián)，選擇感興趣的目的區(qū)間或候選基因，利用Hi-MethylSeq技術(shù)對大規(guī)模群體的候選基因甲基化水平進(jìn)行檢測。

Hi-MethylSeq技術(shù)通過亞硫酸氫鹽（bisulfite）處理，用多重PCR擴(kuò)增目的片段，添加barcode和測序通用接頭，在Illumina X10二代測序平臺對PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，利用生物信息學(xué)方法，精確定量計算目標(biāo)區(qū)間內(nèi)的甲基化位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，在完成目標(biāo)區(qū)域檢測的同時大幅降低研究費(fèi)用。

第二部分：方法技術(shù)

靶向甲基化重測序

翼和策略：目標(biāo)區(qū)間甲基化重測序（Hi-MethylSeq）

優(yōu)勢：Hi-Methylseq結(jié)合了亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換、靶向擴(kuò)增子高通量測序技術(shù)，可實現(xiàn)多區(qū)段、多位點(diǎn)的甲基化精確定量分析。

第三部分：應(yīng)用方向

1、 適用于感興趣的目的片段的甲基化研究 ；

2、適用于在大樣本中進(jìn)一步確認(rèn)全基因組甲基化研究挑選的陽性位點(diǎn)。

文獻(xiàn)：1、 Masser et al. Epigenetics & Chromatin 2013, 6:33

2、Ashktorab et al. Epigenetics 2014, 9(4): 503-512

3、Beth et al. J CHILD PSYCHOL PSYC 2016,2(57):152-160